Struttura e dinamica di proteine

Commessa: MD.P01.008.001 – Struttura e dinamica di proteine
Personale: Patrizia Cioni, Edi Gabellieri, Andrea Mozzarelli, Samanta Raboni, Stefano Bettati, Luca Ronda, Serena Faggiano

L’obiettivo generale è quello di investigare la relazione fra struttura/dinamica e funzione in proteine, utilizzando prevalentemente spettroscopie di fluorescenza e fosforescenza del triptofano. Le metodologie e gli apparati strumentali sviluppati nel nostro laboratorio permettono lo studio di proprietà strutturali e dinamiche di proteine in differenti mezzi e condizioni sperimentali quali: soluzioni acquose, membrane biologiche, ghiaccio, stato secco, micelle, silica gel, film sottili, proteine adsorbite su supporto solido.

Inoltre la nostra strumentazione è utilizzata per studi di alta pressione, fino a 700 MPa.

Gli approcci spettroscopici sono utilizzati per rivelare cambiamenti conformazionali indotti da molteplici fattori quali:

  • binding (substrati, cofattori, inibitori)
  • cambiamento delle condizioni fisiche (temperatura, pressione, salinità, disidratazione)
  • interazione con agenti stabilizzanti o destabilizzanti
  • aggregazione-dissociazione di proteine.

 

Attività in corso:

  • Sviluppo di un nuovo farmaco per la terapia del cancro basato sull’enzima metionina gamma liasi (MGL). Al fine di trasportare MGL alle cellule tumorali e aumentare la sua biodisponibilità, la proteina viene coniugata a nanoparticelle d’oro ricoperte di citrato (sintetizzate nel nostro laboratorio) o PEG e la citotossicità del complesso AuNPs-MGL viene valutata su un pannello di cellule tumorali. Le proprietà fisico-chimiche del complesso (attività enzimatica, grado di legame, distribuzione delle dimensioni, area superficiale, qualità e stabilità dei coniugati, influenza delle nanoparticelle d’oro sulla struttura delle proteine, distribuzione e orientamento dell’MGL nelle interfacce) vengono investigate anche in collaborazione con altre strutture.
  • Caratterizzazione dei determinanti strutturali di stabilità e flessibilità. Nelle proteine funzione, stabilità termodinamica, specificità e affinità di legame sono in molti casi strettamente dipendenti dalle fluttuazioni strutturali. La progettazione di proteine con funzioni e stabilità specifiche può richiedere l’inserimento di caratteristiche strutturali che permettano escursioni dinamiche della struttura. Per un efficace protein design, è di primaria importanza una migliore comprensione della relazione tra struttura e flessibilità. Utilizzando come modello l’azzurrina purificata da Pseudomonas aeruginosa e alcuni suoi mutanti appositamente costruiti, sono investigati gli effetti dell’inserimento di cavità su flessibilità e stabilità. Variando pressione e temperatura vengono condotti esperimenti di denaturazione reversibile. Il lavoro svolto permette di determinare parametri termodinamici quali ΔG, ΔV, ΔCp, Δα, Δβ contribuendo alla descrizione del processo di denaturazione.
  • Denaturazione delle proteine a bassa temperatura. Lo studio della denaturazione a bassa temperatura è fondamentale per comprendere le forze che determinanoil folding delle proteine. Recentemente è stata identificata una proteina, la Fratassina da lievito (Yfh1), la cui denaturazione a bassa temperatura si verifica a temperature sperimentalmente accessibili, vicino a 0 ° C e in condizioni fisiologiche, senza la necessità di aggiungere denaturanti. Vengono condotti esperimenti variando sia pressione che temperatura con lo scopo di misurare i parametri termodinamici della denaturazione e di contribuire a chiarire il meccanismo che determina la “cold denaturation”.
  • Studio di proteine intrinsecamente disordinata. Mediante misure di fluorescenza sono caratterizzate le risposte di proNGF e NGF alla pressione. Il confronto fra le due proteine permette di valutare il contributo del pro-peptide, proteina intrinsecamente disordinata, alla stabilità della struttura proteica.

 

Keywords: fluorescenza, fosforescenza, alta pressione, proteine, stabilità, flessibilità, folding, aggregazione proteica, denaturazione a bassa temperatura, nanoparticelle d’oro

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