Commessa: MD.P01.008.001 – Struttura e dinamica di proteine
Personale: Giovanni Cercignani, Giuliano Colombetti, Francesco Lenci, Sabina Lucia, Roberto Marangoni
Descrizione
La capacità di percepire e trasdurre stimoli luminosi permette a diversi microrganismi di utilizzare la luce come sorgente d’informazione per modulare e modificare il proprio movimento in funzione delle condizioni d’illuminazione dell’ambiente, che è a sua volta prerequisito per la ricerca e il raggiungimento delle migliori condizioni di sopravvivenza. La comprensione dei meccanismi di trasduzione del segnale richiede la conoscenza delle strutture e dei processi che accoppiano la percezione delle differenti caratteristiche del segnale luminoso (composizione spettrale, intensità, direzione, grado di polarizzazione) alla risposta comportamentale (alterazione del battito ciliare o flagellare). Un primo passo è quindi lo studio della localizzazione e delle caratteristiche spettroscopiche dei pigmenti endogeni in cellule intatte. Si deve poi chiarire quali siano i meccanismi di trasduzione del segnale luminoso, cioè quali siano i cammini metabolici che a partire dallo stato segnalante portano alla regolazione del battito ciliare o flagellare.
Tecniche principali
Analisi d’immagine per il tracking dei microorganismi
Spettroscopia: assorbimento, fluorescenza
Microscopia di fluorescenza tradizionale e confocale
Attività in corso
In collaborazione con il Center of Membrane, Texas Medical School, sono stati ottenuti ceppi ricombinanti di Halobacterium salinarum in cui le proteine fotorecettrici sensorie, SRI e SRII, sono legate alla Green Fluorescence Protein (GFP). L’idea alla base di questo progetto e su cui si sta proseguendo la ricerca è di analizzare sia da un punto di vista comportamentale che strutturale, mediante microscopia di fuorescenza confocale e non, i ricombinanti ottenuti, per comprovare l’esistenza di una distribuzione ordinata bidimensionale delle rodopsine sensorie nella membrana cellulare e di una loro interazione spaziale come possibile step di modulazione della fotorisposta, quest’ultima è, peraltro, suggerita dai dati comportamentali sin qui acquisiti su ceppi non ricombinanti.
Nell’intento di studiare un possibile utilizzo delle proteine fotorecettrici in applicazioni biotecnologiche abbiamo iniziato con la Batteriorodopsina (BR), proteina molto studiata e su cui negli ultimi anni c’è un rinnovato interesse di tipo applicativo. Come primo step è stato messo a punto un protocollo di purificazione delle “purple membranes”, membrane contenenti BR, che consente di ottenere un’alta resa del campione con tempi molto più brevi rispetto alle procedure descritte in letteratura.
Keywords: Fotomovimenti, fototrasduzione, protozoi ciliati, archeobatteri, fluorescenza, microscopia confocale.